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脂肪酶制剂 - 脂肪酶制剂的酶活力和动态滴定法测定脂肪酶的酶活力

发布日期:2021-03-09   浏览量:255


GB/T 23535-2009 脂肪酶制剂

范围
本标准规定了脂肪酶制剂的术语和定义、产品分类、要求、试验方法、检验规则和标志、包装、运输、贮存。
本标准适用于以淀粉质(或糖质)为原料,经微生物发酵、提纯制得的中性脂肪酶制剂的生产、检验和销售。

术语和定义
下列术语和定义适用于本标准。
脂肪酶  lipase
能水解甘油三酯或脂肪酸酯产生单或双甘油酯和游离脂肪酸,将天然油脂水解为脂肪酸及甘油,同时也能催化酯合成和酯交换反应的酶。
脂肪酶活力  activity of lipase
脂肪酶活力以脂肪酶活力单位表示,定义为1g固体酶粉(或1mL液体酶),在一定温度和pH条件下,1min水解底物产生1μmol的可滴定的脂肪酸,即为1个酶活力单位,以u/g(u/mL)表示。

产品分类
按产品的应用领域
A类产品一一食品工业和饲料工业用酶制剂。
B类产品一一其他工业用酶制剂。
按产品形态
固体剂型酶制剂和液体剂型酶制剂。

要求
外观
固体剂型: 白色至黄褐色粉末或颗粒,无结块、无潮解现象。无异味。有特殊发酵气味。
液体剂型: 浅黄色至棕褐色液体,允许有少量凝聚物。无异味。有特殊发酵气味。
理化要求
应符合表1的规定。


卫生要求
应符合国家有关规定。

试验方法
酶活力
原理
脂肪酶在一定条件下,能使甘油三酯水解成脂肪酸、甘油二酯、甘油单酯和甘油,所释放的脂肪酸可用标准碱溶液进行中和滴定,用pH计或酚酞指示液指示反应终点,根据消耗的碱量,计算其酶活力。
反应式为:

注1: 酯酶的存在会使检测的脂肪酶的活力增加。蛋白酶的存在会降解脂肪酶,从而使检测到的脂肪酶的活力减小。
注2: 洗涤剂的存在会严重影响本方法。依不同洗涤剂的类型和浓度不同,这种影响表现为从完全抑制到激活。
注3: 酶会附着在塑料上,因此应用玻璃器皿溶解稀释,同时也应用玻璃器皿滴定。在溶液的转移中如果时间很短,且选择适当的塑料材质,可以使用塑料移液枪头。

分析步骤
待测酶液的制备
一一称取酶样品1g~2g,精.确至0.0002g,用磷酸缓冲液溶解并稀释。如果样品为粉状,可用少量磷酸缓冲液溶解后用玻璃棒捣研,然后将上清液小心倾入容量瓶中。若有剩余残渣,再加少量磷酸缓冲液充分研磨,终样品全部移入容量瓶中,用磷酸缓冲液定容至刻度,摇匀,转入高速匀浆机组织捣碎机捣研3min后供测定。
一一测定时控制酶液浓度,样品与对照消耗碱量之差控制在1mL~2mL范围内。
吸取样品时,应将酶液摇匀后再取。

测定
电位滴定法(第.一法)
a) 按pH计使用说明书进行仪器校正;
b) 取两个100mL烧杯,于空白杯(A)和样品杯(B)中各加入底物溶液4.00mL和磷酸缓冲液5.00mL,再于A杯中加入95%乙醇15.00mL,于40°C±0.2°C水浴中预热5min,然后于A、B杯中各加待测酶液1.00mL,立即混匀计时,准确反应15min后,于B杯中立即补加95%乙醇15.00mL终止反应,取出;
c) 在烧杯中加入一枚转子,置于电磁搅拌器上,边搅拌,边用氢氧化钠标准溶液滴定,直至pH10.3,为滴定终点,记录消耗氢氧化钠标准溶液的体积。
指示剂滴定法(第二法)
a) 取两个100mL三角瓶,分别于空白瓶(A)和样品瓶(B)中各加入底物溶液4.00mL和磷酸缓冲液5.00mL,再于A瓶中加入95%乙醇15.00mL,于40°C±0.2°C水浴中预热5min,然后于A、B瓶中各加待测酶液1.00mL,立即混匀计时,准确反应15min后,于B瓶中立即补加95%乙醇15.0mL终止反应,取出;
b) 于空白和样品溶液中各加酚酞指示液两滴,用氢氧化钠标准溶液滴定,直至微红色并保持30s不褪色为滴定终点,记录消耗氢氧化钠标准溶液的体积。

计算
脂肪酶制剂的酶活力按式(1)计算:

式中:
X1一一样品的酶活力,u/g;
V1一一滴定样品时消耗氢氧化钠标准溶液的体积,单位为毫升(mL);
V2一一滴定空白时消耗氢氧化钠标准溶液的体积,单位为毫升(mL);
c  一一氢氧化钠标准溶液浓度,单位为摩尔每升(mol/L);
50一一0.05mol/L氢氧化钠溶液1.00mL相当于脂肪酸50μmol;
n1一一样品的稀释倍数;
0.05一一氢氧化钠标准溶液浓度换算系数;
1/15一一反应时间15min,以1min计。
所得结果表示至整数。
精密度
在重复性条件下获得的两次独立测定结果的绝.对差值不得超过算术平均值的2%。

附录A  (资料性附录)
动态滴定法测定脂肪酶的酶活力

范围
本方法适用于测定含有或混有脂肪酶/酯酶样品中的脂肪酶活力。
特殊的脂肪酶或特殊的成品制剂在样品制备阶段需采用特殊的稳定或抽提手段以保证检测到所有的脂肪酶活力。

原理
脂肪酶水解甘油三酯生成脂肪酸,使反应体系的pH不断下降。通过连续加入碱的方法保持反应体系的pH恒定。碱滴定的速率与酶活力成比例。
注1: 酯酶的存在会使检测的脂肪酶的活力增加。蛋白酶的存在会降解脂肪酶,从而使检测到的脂肪酶的活力减小。
注2: 洗涤剂的存在会严重影响本方法。依不同洗涤剂的类型和浓度不同,这种影响表现为从完全抑制到激活。
注3: 酶会附着在塑料上,因此应用玻璃器皿溶解稀释,同时也应用玻璃器皿滴定。在溶液的转移中如果时间很短,且选择适当的塑料材质,可以使用塑料移液枪头。
反应式

反应条件
温度: 30°C±1°C。
pH: 7.00。
底物浓度: 0.16mol/L的三丁酸甘油酯。
反应时间: 至少1.5min(只有线性反应区用于计算斜率)。
分析范围
样品的分析范围是0.2u/mL~4.0u/mL。如果可能,所有样品应在1.5u/mL~4.0u/mL的范围内被分析。
检测限
对于液体样品检测限为20u/g,相当于2.5g样品溶解在10mL溶液中,然后再稀释25倍。对于固体样品检测限为50u/g,相当于1.0g样品溶解在10mL溶液中,然后再稀释25倍。

仪器和设备
具有动态滴定(pH-stat)功能的滴定仪。在动态滴定仪中还要注意选择适当的pH电极(对pH值响应快)和滴定分配样品准确(特别是滴定氢氧化钠)。还要选择玻璃滴定容器(带水浴夹套)和有效的搅拌器(棒状螺旋搅拌器优于磁力搅拌),这样才构成完整的系统。
乳化器。
恒温水浴: 精度±0.2°C。
温度计: 精度±0.2°C。
自动移液器。

试剂
除非另有说明,在分析中仅使用确认为分析纯的试剂和蒸馏水或去离子水或相当纯度的水。
三丁酸甘油酶(C15H26O6)。
氯化钠(NaCl)。
磷酸二氢钾(KH2PO4)。
阿拉伯胶。
甘氨酸(H2NCH2COOH)。
甘油[HOCH2CH(OH)CH2OH]。
氢氧化钠片剂(NaOH)。
电极校正液(pH7.0)。
电极校正液(pH4.01)。
96%乙醇。
氮气(N2)。
氢氧化钠溶液[c(NaOH)=1mol/L]: 按照 GB/T 601 配制。
氢氧化钠滴定液[c(NaOH)=0.025mol/L]: 取上述溶液25mL,用水稀释并定容到1000mL。
配好后需用适宜的设备脱气。
氢氧化钠滴定液[c(NaOH)=0.005mol/L]: 取氢氧化钠滴定液25mL,用水稀释并定容到5000mL。
乳化剂: 分别称取阿拉伯胶30.0g、氯化钠53.7g和磷酸二氢钾1.20g。量取甘油1620mL 。
将大约180mL去离子水倒入400mL的烧杯中,加入搅拌子,开始高速搅拌,将阿拉伯胶缓慢倒入水中,不断搅拌直至全部溶解。将称好的氯化钠和磷酸二氢钾转入到3L容量瓶中,加350mL水充分搅拌直至完全溶解,将甘油全部加入。将阿拉伯胶溶液转入容量瓶中,充分搅拌后用水定容。
底物乳剂: 称取三丁酸甘油酯62.5g,分别量取乳化剂200mL和水940mL,混合。将混合液匀浆器处理3min(7000r/min)。匀浆后的溶液先用普通的磁力搅拌搅拌至少20min,然后调节pH到4.75±0.05。
不同来源和批号的三丁酸甘油酯和阿拉伯胶对试验结果有影响,在更换产品或批号前需进行有效性确认。
甘氨酸缓冲液1(7.51g/L): 称取甘氨酸37.54g和氢氧化钠片剂18.5g,用水溶解并定容到5L。如需要,调节溶液的pH到10.8±0.05。
甘氨酸缓冲液2(0.75g/L): 取100mL上述甘氨酸缓冲液1,用水定容到1000mL。如需要,调节溶液的pH到10.8±0.05。

标准曲线和样品处理
标准曲线
称取一定量的已知活力酶标准品,精.确到0.0001g。然后用甘氨酸缓冲液2溶解并稀释,制成标准储备液。标准储备液的浓度为20u/mL。然后按照表A.1配制溶液,并绘制标准曲线。


标准对照
可使用已知活力的样品作为标准对照。标准对照的处理同样品。
样品处理
不同的样品需做不同的预处理,以激活或保护在样品基质中的脂肪酶。
可考虑采用甘氨酸缓冲液1和水来分别溶解和稀释样品的方法,或甘氨酸缓冲液2来溶解和稀释样品的方法,或直接用水溶解和稀释样品的方法,以求得到.好的效果。样品的溶解液和稀释液应充分搅拌均匀。
样品应终稀释到酶活力在1.5u/mL~4.0u/mL范围内。
如可能,样品稀释完应立即测定。

分析步骤
系统准备
按照无水乙醇、适当的肥皂水、热水、去离子水、底物的顺序清洗滴定容器和管路。
保证水浴的温度在30.0°C±0.5°C。
校正pH电极: 每天使用前要校正pH电极的灵敏度在95%~102%;pH7.00应在6.985~6.989之间;pH4.01应在4.009~4.012之间。如果达不到此标准,按照pH电极使用说明进行冲洗并再次校正。
分析
pH电极用后浸泡在饱和的氯化.钾(KCl)溶液中,使用前冲洗。
在反应溶液表面用氮气吹充,以防止空气中二氧化碳的干扰。分析前一定要保证底物的温度为30.0°C±0.5°C。
在分析每个样品前要用0.005mol/L的氢氧化钠溶液冲洗滴定皿和管路。
试验步骤如下:
一一将15mL的底物加入到滴定皿中。滴定前pH电极的读数应小于7.0。
一一加1mL样品稀释液加入到滴定皿中。反应体系的pH在滴定过程中保持在7.0。记录为保持恒定pH而加入的滴定液的量。
一一滴定结束后滴定仪打印出滴定曲线线性范围的平均斜率(如果使用不同的设备,数据可能以其他形式输出)。滴定曲线应有一段持续1.5min的线性输出。
一一先分析标准曲线(每个标准点分析1次),然后分析一个标准对照,再分析样品(每个样品分析1次)。重要的是一天之中非一次运行的样品不能使用相同的标准曲线。事先应知道每一次运行的样品的个数。如果样品在当天晚些时候分析,标准溶液要重新分析。
一一每个样品分析前和后一个样品完成分析后,系统将进行冲洗。排空底物容器和管路,并用乙醇冲洗。如果系统将会在1周以上时间不再使用,则需要用去离子水进行冲洗并用氢氧化钠溶液或相同浓度的盐酸溶液充满敏感部件,避免出现盐类结晶。

计算
结果计算
利用标准点的测定值作标准曲线,其中X 轴为标准品酶活力, Y 轴为相应的滴定反应的平均斜率(mL/min)。标准曲线应该是一条直线。样品稀释液的活力从标准曲线中读出,然后按式(A.1)计算:

式中:
X3一一样品的酶活力,u/g;
A 一一稀释样品在标准曲线上读出的酶活力,u/mL;
V3一一样品溶解用的容量瓶体积,单位为毫升(mL);
n2一一第二次稀释的倍数;
m3一一样品的质量,单位为克(g)。
结果的确认
当满足以下条件时可以确认本次分析有效:
一一标准对照的检测值在本方法所规定的可接受偏差范围内;
一一标准曲线的斜率应满足: 1) 标准点1小于0.02mL/min;2) 标准点6在0.14mL/min~0.18mL/min之间;
一一标准曲线的相关系数(r2)大于等于0.995;
一一标准点~点6的相关系数的应大于0.9995。标准点1~2的r2大于0.995是可接受的。
如果达不到此条件,应检查分析系统。
结果的表示
结果给出3位有效数字。如果结果低于检测限,则表示为<20u/g(液体)或<50u/g(固体)。
精密度
在重复性条件下获得的两次独立测定结果的绝.对差值不得超过算术平均值的5%。


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